微滴式數(shù)字PCR儀退火溫度設(shè)置得太低可能導致非特異性PCR產(chǎn)物的擴增；退火溫度過高可能會降低PCR擴增效率，降低目標產(chǎn)物的產(chǎn)量。

 

　　微滴式數(shù)字PCR儀理想的退火溫度跟多個因素有關(guān)。要找到理想的Ta溫度，需要嘗試不同的溫度下重復(fù)測試相同的反應(yīng)體系，這需要耗費更多時間和試劑耗材。

 

　　其實與經(jīng)典PCR反應(yīng)一樣，使用具有溫度梯度功能的熱循環(huán)儀可以很容易地確定微滴式數(shù)字PCR反應(yīng)體系理想的退火溫度，在一次實驗中即可同時測試8個不同退火溫度，以篩選出理想的溫度條件。

 

　　所謂溫度梯度，即在標準的96孔PCR儀中，各行/列在同一個溫度步驟中產(chǎn)生不同的溫度。在一次運行中即可考察不同溫度對PCR擴增效果的影響，極大地減少實驗次數(shù)，避免重復(fù)實驗產(chǎn)生的不確定因素造成的影響。

 

　　對于某些難度更大的稀有突變檢測實驗中，由于野生型背景的干擾以及引物探針設(shè)計困難，很可能出現(xiàn)非特異性擴增。這時ddPCR體系的退火溫度不僅要確保陽性微滴和陰性微滴的區(qū)分，還要確保僅發(fā)生非特異性的微滴與特異性擴增的微滴明確分開。

 

　　在沒有溫度梯度功能加持的情況下，相同的數(shù)字PCR體系優(yōu)化和構(gòu)建可能需要經(jīng)過十數(shù)次重復(fù)實驗來測試不同退火溫度條件下的實驗效果。此外也需要指出，并非所有的數(shù)字PCR技術(shù)都能通過溫度梯度的方式優(yōu)化檢測體系，目前僅兼容標準PCR熱循環(huán)儀的數(shù)字PCR平臺才能使用溫度梯度熱循環(huán)程序。溫度梯度功能是快速優(yōu)化、構(gòu)建數(shù)字PCR反應(yīng)體系的利器，能大大減少體系優(yōu)化階段數(shù)字PCR試劑耗材的額外消耗，縮短工作時間，快速取得理想的實驗結(jié)果。